Количественный in situ микробиологический анализ по липидным маркерам в биологических жидкостях с использованием метода газовой хроматографии – масс спектрометрии * * * Осипов Г.А., ведущий научный сотрудник, доктор биологических наук, профессор Федосова Н.Ф., заведующая клинико-диагностической лабораторией Лядов К.В. , директор, член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор ФГУ Лечебно-реабилитационный центр Росздрава Введение Метод масс-спектрометрии микробных маркеров разработан в России и с 1991 года используется для количественного анализа таксономического (родового или видового) состава микробных сообществ в медицине, экологии и биотехнологии [Осипов, 1993]. В его основе лежит высокоточное определение присутствия молекулярных признаков микроорганизмов (маркеров) из числа их клеточных липидов – высших жирных кислот, альдегидов, спиртов и стеролов в анализируемой пробе. Определение производится высокочувствительным и селективным методом газовой хроматографии – масс спектрометрии (ГХ-МС), позволяющим одновременно измерять более сотни микробных маркеров непосредственно в анализируемом материале, крови, моче, биоптатах, пунктатах, мокроте, и других биологических жидкостях и тканях без предварительного посева на питательные среды или использования тестовых биохимических материалов. Разработан автоматический алгоритм анализа с помощью штатных программ ГХ-МС, позволяющих определить концентрацию более 50 микроорганизмов в материале через три часа после его поступления в лабораторию. Метод подтвержден патентами на изобретения, его научная обоснованность заключена в двенадцати кандидатских и докторских диссертациях, четырех патентах и десятках публикаций в научной периодике, в том числе в иностранных реферируемых журналах. Метод рекомендован к клиническому использованию в руководствах и пособиях для врачей [Роль.., 1998; Осипов, 2005; Дисбактериоз…, 2007]. Данная технология разработана на основании 15 летнего опыта хромато-масс-спектрометрического анализа клинических образцов крови и других биологических жидкостей (мочи, слюны, вагинального и уретрального секрета, мокроты, ликвора, пунктатов, боптатов и пр.), а также инфицированных тканей. Применяемые на сегодняшний день в клинической практике методы диагностики инфекции имеют определенные ограничения и недостатки. Например, существенным недостатком классического бактериологического исследования, помимо дороговизны и длительности (7-10 дней), является невозможность оценить роль некультивируемых микроорганизмов в инфекционно-воспалительном процессе, прежде всего – анаэробов. При этом в большинстве случаев в клинической практике приходится работать со смешанной аэробно-анаэробной микрофлорой, что значительно затрудняет диагностику и требует высокой квалификации специалиста. Используемый в сомнительных случаях в качестве дополнительного к классическому иммуно-серологический метод является непрямым - определяется не возбудитель, а иммунный ответ на него, который может иметь индивидуальные вариации. Это является серьезной помехой для интерпретации результатов и принятия адекватных клинических решений. Известные молекулярно-биологические методы (ПЦР, гибридизация РНК и ДНК), при несомненных преимуществах - прямое определение возбудителя, высокие специфичность и чувствительность, универсальность, скорость, возможность диагностики хронических и латентных инфекций – имеют такие серьезные недостатки, как частые ложно-положительные результаты и невозможность адекватной количественной оценки. Из всего вышесказанного вытекает очевидная востребованность в надежном экспрессном методе диагностики возбудителей инфекции. Метод газовой хроматографии масс-спектрометрии (ГХ-МС) позволяет детектировать в исследуемых образцах маркеры – компоненты микробной клетки – широкого спектра микроорганизмов собственной и инородной микробиоты человека. Метод является высокочувствительным, экспрессным (3 часа на полный цикл исследования), универсальным, экономичным и имеет широкий диагностический спектр. Он легко поддается стандартизации, для его реализации используются доступные любым лабораториям химические реактивы и методики проб подготовки. Метод автоматизирован, что обуславливает простоту лабораторной диагностики. Предлагаемый метод ГХ-МС обеспечивает возможность при проведении анализа одного образца одновременной детекции десятков маркеров микроорганизмов. Диагностические возможности метода для выявления маркеров в клинических материалах представляются перспективными. Поэтому в ФГУ Лечебно-реабилитационный центр Росздрава (директор – член-корреспондент РАМН К.В.Лядов) в течение 2,5 лет проводились клинические испытания, результаты которых приводятся в настоящей работе.